λ噬菌体的特点λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体。第二节λ噬菌体载体λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体，λ噬菌体载体的主要用途噬菌体，由于黏粒载体带有噬菌体的包装序列，可以用包装蛋白包装，不带外源DNA片段的载体因为包装下限而不能被包装，具有很强选择性。

【答案】：(1)材料：海水，枯草芽孢杆菌；培养基：3.0%NaCl肉汤固体培养基，3.0%NaCl肉汤液体培养基，3.0%NaCl肉汤半固体培养基；器皿：平皿，试管，三角瓶等。(2)步骤：噬菌体的繁殖(将枯草芽孢杆菌接种到肉汤液体培养基中，32℃培养12h，使细胞处于对数期；加入1ml海水，摇匀培养24h，离心得到上清液；

噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主，较为人知的噬菌体是以大肠杆菌为寄主的T2噬菌体。跟别的病毒一样，噬菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。

黏粒英文cosmid，指带有黏端位点(cos)的质粒。黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。黏粒有4个特点：①具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。

粘粒克隆载体由质粒和含有cos位点的λDNA片段所组成，大小一般在5~7Kb,包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载40Kb左右的外源DNA片段。由于黏粒载体带有噬菌体的包装序列，可以用包装蛋白包装，不带外源DNA片段的载体因为包装下限而不能被包装，具有很强选择性。

2.1单链丝状噬菌体展示系统（1）PⅢ展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白[3]，其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域[45]，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关[6]，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端[7]。

（1）λ噬菌体克隆载体：λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感染能力。λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5′凸出黏性末端（cohesive：end），而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状DNA分子。把此末端称为emphasis：roleitaliccosemphasis位点（cohesive：end：site）。

构建λ噬菌体克隆载体的策略是：①用合适的限制性内切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插入必需区；②若有必要可在非必需区插入选择标记基因；③构建的λDNA载体不应小于36.4kb。

噬菌体。利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacIlacZ’序列，和多克隆位点等。

（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在10。（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。

另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。

λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体。λ噬菌体是双链DNA噬菌体，有直径55nm的二十面体头部，末端有细长尾丝的非收缩尾。DNA是线性分子，有粘性末端即单链延伸12个核苷酸，故感染后线性基因组可立即环化。λDNA有一个噬菌体结合位点，可与细菌结合位点形成碱基配对，细菌结合位点位于大肠杆菌染色体上半乳糖或gal操纵子和生物素操纵子之间。

λ噬菌体的基因组长达50Kb，共61个基因，其中38个较为重要。其生活史如图815所示，可分为裂解周期和溶原周期。细菌处于溶原化状态时，细胞质中有一些λCI基因的产物CI蛋白（见第十八章）,这是一种阻遏蛋白，可以阻止λ左、右两个早期起动子的转录，使之不能产生一些复制及细胞裂解的蛋白。λ的DNA随着宿主的染色体复制而复制。

第二节λ噬菌体载体λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。λ噬菌体的分子量为31×106dal，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。

注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′P和3′OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesiveendsite的缩写，即粘性末端位点之意）（图55）。